Считывание генома подешевело до $4400

Год назад неизвестная дотоле калифорнийская компания Complete Genomics шокировала публику, пообещав уже в первой половине 2009 года прочитать человеческий геном по цене в $5 тыс. Наглость по тем временам была неслыханной -- себестоимость самого дешевого на тот момент генома находилась на уровне $70-100 тыс. Столько стоили расходные материалы, потребовавшиеся на расшифровку генома мужчины из нигерийского племени Йоруба, которую конкуренты из Applied Biosystems завершили в феврале 2008 года.

Быстрей компьютера

Между тем, если руководствоваться генетическим аналогом «закона Мура», обещание Complete Genomics было вполне естественным -- более того, кто первый в него поверил, тот и должен был оказаться на коне, собрав максимум заказов. Закон Мура, как известно, утверждает, что производительность компьютеров удваивается каждые полтора года. Если же посмотреть на цену считывания человеческого генома, она за этот же период падала в среднем в десять раз.

За год до нигерийца свою последовательность ДНК выяснил первооткрыватель ее двойной структуры Джеймс Уотсон, что стоило около $1 млн, а за год-полтора до этого была прочитана ДНК его извечного антагониста Крейга Вентера, что стоило около $10 млн. Стоимость же опорного генома человека, синтез которого завершился в 2003 году, составляла около $300-400 млн; правда, в последнюю сумму входят все затраты, и сравнивать ее со стоимостью одних лишь расходных материалов (как для нигерийца, Уотсона и Вентера) некорректно.

Экономия на всем

В свежем номере Science опубликована статья ученых из Complete Genomics и медицинских факультетов Гарварда и Университета имени Вашингтона в Сент-Луисе, которая доказывает, что обещания компании были не напрасными. Авторы работы под руководством главного ученого Complete Genomics (должность с таким смешным названием есть во многих американских компаниях) Радое Дрманача описывают считывание трех полных человеческих геномов, которые стоили от $1726 до $8005. Средняя себестоимость составила $4400. Новый ВАЗ-2105, для сравнения, стоит сегодня около $5600.

Ключ к снижению цен -- это меньший расход реагентов. Многочисленные ферменты, нужные для нарезки и размножения ДНК, а также считывания полученных фрагментов, стоят очень дорого, а омывать ими образцы исследуемой молекулы приходится по многу раз. Чтобы избежать этого, компания Helicos, за которой был рекорд дешевизны последние три месяца, вовсе не размножает ДНК, а считывает единственную нарезанную на мелкие кусочки молекулу. Стоимость реагентов, потребовавшихся для августовского секвенирования этим способом, составила $50 тыс.

Complete Genomics пошла другим путем. Новая технология тоже требует размножения ДНК, но делается это достаточно хитрым способом. Ученые постарались миниатюризировать все химические манипуляции, чтобы дорогостоящие вещества не растекались по стеклянным пластинкам даром. Кроме того, сам процесс размножения устроен так, что каждая молекула фермента выполняет свою работу несколько десятков раз.

Наношарики

Все начинается с того, что нужная молекула ДНК разбивается на короткие фрагменты с помощью ультразвука. Затем концы этих фрагментов склеиваются, а в получившееся кольцо в нужных местах вставляются заранее известные, «маркерные» олигонуклеотиды строго определенной длины. А дальше, наверное, самый интересный трюк -- ученые добавляют к этим ДНК-колечкам специальный фермент, который некоторые вирусы используют для копирования своей кольцеобразной ДНК. Этот фермент работает без остановки, кружась по кольцу до тех пор, пока его не смоют или в окрестностях фермента не закончатся нуклеотиды, из которых можно делать копии.

В результате за ферментом тянется длиннющий хвост из многочисленных копий кольца (вместе с внедренными в него маркерными олигонуклеотидами), который сам собой сворачивается в комок, чем-то напоминающий запутанную рыболовную леску -- только размером меньше микрона. Эти комочки ученые называют ДНК-наношариками, и именно с них в итоге считывается последовательность нуклеотидов ДНК.

Эти комочки ученые помещают на тонкую пластинку размером 25 мм на 75 мм, в которой ровными рядочками, плечом к плечу (чтобы не тратить реактивы попусту), выстроены 350 млн микроскопических углублений. Попав в углубление, ДНК-наношар задерживается там межмолекулярными силами, так что в итоге на каждой пластинке получается 350 млн образцов, в каждом из которых находятся несколько десятков нуклеотидов исходной ДНК -- многократно размноженных и спутанных в комок. Остается их только считать.

И так сойдет

Для считывания ученые используют свет. К массивам ДНК подмешивают специальные светящиеся молекулы-индикаторы. Они надежно прикрепляются к исследуемой ДНК лишь в том случае, если один из концов молекулы держится за вставленные в исходное кольцо маркеры, а второй -- за определенный нуклеотид ДНК, расположенный на строго определенном расстоянии от конца маркера. Такие индикаторы добавляются в четырех вариантах, светящихся разным цветом, в зависимости от нуклеотида, с которым они спариваются.

Все лишние индикаторы, не прицепившиеся к ДНК, смывают, так что по цвету свечения сразу видно, какой нуклеотид находится в заданной позиции. Эту процедуру повторяют несколько раз, каждый раз сдвигаясь на очередной шаг от маркерного участка. Так ученые узнают всю последовательность между маркерами. Затем остается только сцепить эти короткие последовательности воедино, сравнивая их с опорным геномом. Весь процесс занимает чуть более суток.

Преимущество сворачивания ДНК в комочки проявляет здесь себя в полной мере. Все многочисленные копии исходного кольца внутри каждого комочка идентичны. Это значит, что метод не очень чувствителен к ошибкам в изготовлении светящихся молекул -- даже если там будет примесь «неподходящих» молекул, ее свечение потонет в свете десятков «правильных» индикаторов. Для одномолекулярной технологии, вроде той, что использует Helios, такая примесь означала бы неминуемую ошибку, поэтому индикаторы должны быть изготовлены с очень высоким качеством. В случае наношариков качество не так важно, и это тоже снижает стоимость реагентов.

Всего специалисты Complete Genomics считали три полных человеческих генома. Первый из них принадлежит белому мужчине европейского происхождения, второй -- женщине из Нигерии. Оба этих генома частично считаны в рамках проекта HapMap, а женский к тому же вскоре должен быть считан полностью в рамках проекта «1000 геномов». Третья ДНК извлечена из кровяной клетки-предшественника больного раком крови. Эти образцы ученые выбрали для сравнения своих результатов с известными последовательностями и генетическими аномалиями. Чистоту метода на основании этих данных Complete Genomics оценивает в меньше чем одна ошибка на 100 тыс. нуклеотидов.

Для людей, не для коней

Стоит отметить, что новая методика работает только в случае, если для изучаемого генома существует так называемая опорная последовательность -- например, последовательность ДНК, определенная для другого представителя того же или очень близкого биологического вида. Хотя фрагменты ДНК считываются многократно (от 40 до 80 раз), это все время одни и те же фрагменты, к тому же очень короткие.

Сложить из этих коротеньких кусочков в 60-70 букв библиотеку полного генетического кода невозможно. Так что для определения генома новых видов (например, коня, описанного в том же номере Science), приходится пользоваться другими методами, в которых, если пользоваться той же аналогией, библиотека сначала многократно копируется, а затем разрывается на клочки по несколько строчек.

Вместе с тем для медицинских и исследовательских приложений технология Complete Genomics как раз то, что нужно. Во-первых, потому что опорный человеческий геном существует уже шесть лет. Во-вторых, потому что с медицинской точки зрения наиболее интересны как раз отличия геномов друг от друга. Ну и наконец, потому, что $4400 -- это уже вполне разумная цена, доступная многим покупателям.

Правда, с частными покупателями компания не работает -- принимать заказы она собирается только у больших контор, которые уже сейчас предлагают своим клиентам услуги по определению и истолкованию их ДНК. Сейчас это стоит около $100 тыс. Посмотрим, как эта сумма изменится в ближайшие годы.